Úvod

Neinvazivní prenatální screening vrozených vad pomocí volných fragmentů kyseliny deoxyribonukleové (cfDNA) umožnilo zjištění, že cfDNA v plazmě těhotných je směsí tvořenou DNA z apoptotických mateřských buněk (průměrně 90 % cfDNA) a buněk trofoblastu (průměrně 10 % cfDNA) (1). K detekci cfDNA v mateřské plazmě a výpočtu relativního zastoupení fragmentů příslušejících ke sledovaným chromozomům a klinicky významným oblastem genomu se používají různé laboratorní a statistické metody využívající rychlého vývoje molekulárně genetických metod a počítačové techniky (2,3,4,5,6). Od doby klinické implementace roku 2012 bylo podáno dostatek důkazů o vysoké efektivitě neinvazivního prenatálního testování pomocí cfDNA (NIPT) a jeho limitujících a korigujících faktorech (7,8). Současné metody NIPT významně ovlivnily způsob prenatálního screeningu častých aneuploidií - trizomií chromozomů č. 21 (T21), č. 18 (T18) a č. 13 (T13) (9,10). Metody NIPT pro screening aneuploidií pohlavních chromozomů, subchromozomální deleční a duplikační varianty počtu kopií (CNV) nebo prenatální diagnózu monogenních chorob (NIPD) se vyvíjejí a současné názory na jejich implementaci jsou kontroverzní (11,12).
Kontingentní NIPT screening zaměřený na časté aneuploidie je jednou ze strategií inkorporující NIPT do screeningového systému častých aneuploidií (13,14). Naše modifikace kontingentního NIPT screeningu vychází z doporučení Společnosti lékařské genetiky a genomiky (SLG) k indikaci NIPT (15) a doporučení k provádění diagnostických prenatálních vyšetření (16). Základním screeningovým vyšetřením je kombinovaný test v prvním trimestru (FTS), jehož výsledky rozdělují těhotné do tří skupin (kontingentů):

1. s vysokým kombinovaným rizikem aneuploidie (> 1/100), ultrazvukovým nálezem nebo snížením jednoho z biochemických markerů pod 0,2 násobku mediánu (MoM) (17), kterým je doporučena genetická konzultace. Diagnostickým vyšetřením první volby je rychlé stanovení T21, T18, T13, aneuploidií pohlavních chromozomů a polyploidií pomocí kvantitativní fluorescenční polymerázové reakce (QFPCR) (18). Následným vyšetřením při negativním výsledku QFPCR je chromozomální microarray (CMA) detekující deleční a duplikační CNV (19). Ve specifických indikacích může být CMA metodou první volby.
2. s intermediárním rizikem v rozmezí 1/100 – 1/500 bez ultrazvukového nálezu (NIPT kontingent) s doporučením NIPT zaměřeným na časté aneuploidie. V případě pozitivního výsledku NIPT je doporučena konfirmace invazivním vyšetřením (většinou AMC).
3. se středním rizikem (kontingent II. trimestru). V současném prostředí regulujícím genetickou prenatální péči a vzhledem k publikovaným datům (13) doporučujeme pokračovat do II. trimestru k provedení integrovaného testu těhotným s rizikem > 1/2 500. Prahové riziko integrovaného testu je 1/150 s očekávanou iniciální pozitivitou 2 % a dalším postupem dle výskedku konzultace.

U všech těhotných doporučujeme expertní ultrazvukové vyšetření ve 20. – 22. týdnu. Invazivní vyšetření je doporučeno vždy při ultrazvukovém nálezu a pro konfirmaci výsledků NIPT.

Materiál a metody

V 2017 – 2019 bylo v laboratořích GENNET vyšetřeno celkem 886 biopsií choria (CVS), 3 028 amniocentéz (AMC) a 3 920 NIPT a diagnostikováno celkem 460 závažných chromozomálních nálezů, jejichž distribuce je uvedena v Tab. 1. Část vzorků byla transportována z jiných pracovišť (převážně ze Sanus Hradec Králové, ÚPMD Praha a FTN Praha). Pro odhad přínosu jednotlivých kontingentů pro prenatální diagnózu častých aneuploidií (T21, T18, T13) jsme použili podskupinu 161 případů T21, které byly geneticky konzultovány na klinikách GENNET a 53 případů T18, u kterých byla známa indikační kritéria. U případů T13 se známými indikačními kritérii byla indikace k diagnóze vždy na základě výsledků FTS. T13 byla proto z této analýzy vyjmuta. Ve sledovaném období bylo na všech klinikách GENNET (Praha, Liberec) a spolupracujícím prenatálním centru Gynekologie MUDr. Brožek, s.r.o. Ústí nad Labem provedeno celkem 24 052 FTS. Část těhotných byla doporučena k FTS nebo genetické konzultaci na klinice GENNET po záchytu na jiném pracovišti. Z výsledků FTS jsme odhadli velikosti jednotlivých kontingentů a jejich ovlivnění věkem.

Výsledky

V rámci kontingentního testu bylo provedeno 3 920 NIPT. Výsledky jsou uvedeny v Tab. 2 a 3. Okrem alterácie hormonálneho metabolizmu estrogénov sa podieľa na znížení inzulínovej rezistencie, priaznivo ovplyvňuje metabolizmus glukózy (6). Vďaka týmto vlastnostiam je I3C predmetom skúmania pri liečbe syndrómu polycystických ovárií (PCOS) (19).

Komentář k Tab. 2 a 3: Iniciální pozitivita (IPR) udává část pozitivních nálezů NIPT, které vyžadují konfirmaci invazivním vyšetřením. Část invazivně konfirmovaných trizomií na základě výsledku NIPT udává pozitivní prediktivní hodnota testu (PPV).

Odhad přínosu jednotlivých segmentů kontingentního screeningu pro diagnózu T21 a T18 podle příslušnosti ke kontingentům na základě výsledků FTS je uveden v Tab. 4.

Komentář k Tab. 4: Trizomie 21 (celkem 161 případů): 85 % případů bylo v kontingentu s vysokým rizikem, 7,5 % případů v NIPT kontingentu a 7,5 % případů v kontingentu II. trimestru (4,5 % výsledky integrovaného testu s rizikem FTS < 1/500, 3 % ultrazvukový nález).
Trizomie 18 (celkem 53 případů): 77 % případů bylo v kontingentu s vysokým rizikem, 6 % případů v NIPT kontingentu a 17 % případů v kontingentu II. trimestru (2 % výsledky integrovaného testu s rizikem FTS < 1/500, 15 % ultrazvukový nález). Výsledek NIPT předcházel diagnostickému prenatálnímu vyšetření u 3/53 případů T18 (6 %). U všech tří případů však byl pozitivní ultrazvukový nález (edém plodu, růstová retardace, meningokéla) a NIPT bylo provedeno spíše z psychologické indikace. U dalšího případu T18 indikovaného podle doporučení nebyl výsledek NIPT vydán pro nízkou fetální frakci a následná indikace k AMC byla provedena na základě UZ nálezu ve II. trimestru.

Retrospektivní stanovení velikosti screeningových kontingentů: Relativní velikost screeningových kontingentů byla stanovena z výsledků 24 052 FTS provedených na klinikách GENNET (průměrný věk těhotných žen 32,5 roku v termínu, 37 % žen ve věku 35 let a více, 120 případů T21, 31 případů T18, 13 případů T13) a jejich ovlivnění věkem těhotné – viz Tab. 5.

Diskuze

Naše výsledky potvrzují úlohu NIPT v kontingentním screeningu hlavně pro diagnózu T21. U trizomií T18 a T13 byly prakticky všechny indikace k diagnostickému vyšetření buď v kontingentu s vysokým rizikem FTS nebo na základě ultrazvukového nálezu. Při vysokém riziku FTS nebo ultrazvukovém nálezu indikace NIPT s velkou pravděpodobností oddálí a prodraží prenatální diagnózu. U prenatální diagnostiky T21 a T18 jsme potvrdili již dříve publikovaný význam integrovaného testu (20). V našem souboru bylo 4,5 % diagnóz T21 a 2 % diagnóz T18 indikováno výsledky integrovaného testu s rizikem FTS < 1/500.
NIPT je součástí prenatálních screeningových programů v řadě zemí většinou v kontingentní strategii, pouze v Holandsku (NL) a Belgii (B) je NIPT univerzálním prenatálním testem s přibližně 50% (NL) a více než 75% (B) utilizací (21). Kontingentní NIPT screening je ekonomicky přijatelnější alternativou se zachováním vysoké detekce častých aneuploidií a snížením invazivních výkonů. Gil et al. (13) uvádí v populaci 11 692 těhotných s průměrným věkem 31 let 3,9 % s rizikem > 1/100 indikovaných k invazivnímu vyšetření a 30,4 % v rozmezí rizik 1/100 – 1/2 500 indikovaných k NIPT s očekávanou detekcí 97 % T21 a 95 % T18 a T13. Wald et al. (14) uvádí ve skupině 22 812 těhotných (medián 31 let, věkové rozmezí 28-35 let) celkem 10 % těhotných indikovaných k NIPT s rizikem FTS vyšším než 1/800 a detekci 95 % T21 a 96 % T18. Kontingenty ve švédské populační studii Iwarssona et al. jsou 4,5 % těhotných s rizikem FTS > 1/200 a 10,2 % s rizikem v rozmezí 1/200 – 1/1 000 (129 493 těhotných, průměr 32 let, 33 % starších 35 let) (22). Výsledkem naší modelové strategie tří kontingentů je kromě 3,8 % výsledků FTS s vysokým rizikem také zpřesnění indikace k NIPT pomocí výsledků integrovaného testu u 25 % vyšetřených s rizikem FTS v rozmezí 1/501 – 1/2 500 (kontingent II. trimestru). Očekávaná iniciální pozitivita integrovaného testu v této rizikové skupině je nižší než 2 %, což představuje méně než 0,5 % screenovaných FTS, které by doplnily primární NIPT kontingent přibližně na 10 % všech screenovaných.
Pozitivní prediktivní hodnota NIPT pro T21 (59 %) a T18 (50 %) byla v našich výsledcích nižší, než je většinou udáváno (23). Hlavním důvodem nižší PPV při NIPT v našem souboru byla kromě zvýšeného základního rizika v NIPT kontingentu (1/100 – 1/500) i určitá opatrnost při hodnocení výsledků. NIPT také nebylo indikováno vždy podle doporučení, především z důvodu ohledů na přání těhotné – část indikovaných k invazivnímu vyšetření výkon odmítla a část indikovaných k NIPT vyžadovala invazivní vyšetření s kompletní informací včetně výsledku CMA. V praxi to ale znamenalo iniciální pozitivitu v kontingentu NIPT a tím i konfirmační invazivní vyšetření pouze u 1,8 % testů (67/3 712).
Pokud vezmeme v úvahu vrozené vývojové vady (VVV), které vedly k spontánnímu potratu nebo umělému přerušení těhotenství a vady s pozdní manifestací, je možno odhadnout prevalenci všech VVV plodu až u 6 % těhotenství. Přibližně u poloviny z nich (u 3 % těhotných) jsou vady plodu multifaktoriální etiologie, často s morfologickým nálezem, 0,5 – 1 % plodů má mikroskopickou chromozomální vadu, 1 % má subchromozomální CNV a 0,5 – 1 % plodů je postiženo monogenní vadou. Časté aneuploidie tedy tvoří přibližně třetinu VVV s prokazatelnou genetickou etiologií, z toho přibližně polovina (celkem 15 % vad) připadá na trizomii chromozomu 21. Současná prenatální genetická diagnostika musí počítat i s klinicky významnými subchromozomálními CNV detekovanými pomocí CMA a vadami způsobenými s mutacemi v jednom genu (monogenní) detekovanými většinou sekvenováním nové generace (NGS) z materiálu plodu. Pro tuto skupinu vad s významným podílem nových mutací stále zůstávají hlavními indikátory rizika FTS nebo integrovaného testu, expertní ultrazvukový nález v I. a II. trimestru nebo významná atypie biochemických markerů FTS. U těchto VVV nemůže současné NIPT konkurovat metodám přímého vyšetření tkání plodu (11,12) i přes rychlý vývoj nových technik NIPT (30). Riziko CNV plodu není ovlivněno věkem těhotné a frekvence klinicky významných CNV u plodů bez prokázané morfologické vady a s normálním klasickým karyotypem je 0,5 – 1,3 % (24). Pravděpodobnost nálezu klinicky významné CNV se zvyšuje při nálezu morfologické vady plodu – CNV jsou prokazovány navíc u 5 – 10 % vyšetřovaných plodů s mnohočetnými vadami a normálním karyotypem (25). V našem materiálu přineslo vyšetření choriové biopsie pomocí CMA u těhotných s významným rizikem FTS závažný nález CNV navíc u 6 % indikovaných. U skupiny AMC s širším spektrem indikací (např. věk, anxiozita, výsledek integrovaného testu, mužský faktor) byly závažné CNV diagnostikovány u 2 % vyšetřených. Celkem CNV představovaly 25 % všech závažných nálezů prenatální diagnostiky. I když u heterogenní skupiny CNV není možné odhadnout část spontánně potracených plodů během dalšího průběhu těhotenství, je pravděpodobné, že poměr CNV k častým aneuploidiím u narozených dětí by byl ještě vyšší. Evans (26) uvádí, že u mladších těhotných je 10x vyšší riziko nálezu CNV než časté aneuploidie zjistitelné pomocí současné NIPT. Použití NIPT jako screeningového testu první volby v Holandsku sice zvýšilo detekci častých aneuploidií spolu se snížením počtu invazivních výkonů, ale došlo k významnému snížení prenatální detekce CNV (10,11). Pro optimální detekci všech atypických chromozomálních nálezů (až 55 % očekávaných) doporučuje Iwarsson (22) invazivní vyšetření u těhotenství s rizikem FTS > 1/200. V dánské studii (27) byla většina CNV diagnostikována ve skupině rizik FTS 1/100 – 1/300.
Dalším zpřesněním prenatální diagnostiky je klinicky dostupné vyšetření exomu (WES) z materiálu plodu zaměřené na mutace v protein kódujících oblastech genomu, které jsou příčinou až 85 % monogenních VVV. Lord et al. (28) uvádí další nárůst nálezů významných genových variant při WES u 8,5 – 15,4 % plodů se strukturálními vadami. Při dostatečné hloubce sekvenace je možné při WES detekovat i varianty počtu kopií (CMV) s vyšší citlivostí (~ 40 Kb) než většina současných CMA. Teoreticky je možné pomocí WES detekovat CNV na úrovni jednoho exonu (~ 200 bp) a samozřejmě i chromozomální aneuploidie a jejich mozaiky. Při optimalizaci doby vyšetření (cca 7 – 10 dní) se může rychlý WES (rWES) stát prenatálním diagnostickým testem první volby (29).

Závěr

Kontingentní NIPT screening a navazující diagnostická prenatální vyšetření podle doporučení SLG (15,16) vytváří spolu s expertním ultrazvukovým vyšetřením efektivní systém prenatální diagnostiky. Kontingent NIPT obohacený výsledky integrovaného testu tvořil v našem modelu přibližně 10 % vyšetřených FTS. U části těhotenství s nejvyšším rizikem častých aneuploidií vyšetřené invazivně (přibližně 4 % výsledků FTS) byly zjištěny další vady nezachytitelné NIPT, které představovaly 25 % všech prenatálně diagnostikovaných nálezů. Vývoj prenatální diagnostiky směřuje ke zvýšení prahu citlivosti NIPT na subchromozomální a genovou úroveň, k vyšetření kolujících fetálních buněk a klinické implementaci prenatálního rWES.

Seznam použitých zkratek:

Literatura

1. Lo YD, Corbetta N, Chamberlain PF, et al. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet. 1997;350(9076):485–7
2. Chiu RW, Allen KC, Gao Y, et al. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma. Proc Natl Acad Sci USA. 2008;105:20458–63
3. Palomaki GE, Kloza EM, Messerlian GM. DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: an international clinical validation study. Genet Med. 2011 Nov;13(11):913-20
4. Nicolaides KH, Syngelaki A, Gil M, Atanasova V, Markova D. Validation of targeted sequencing of single-nucleotide polymorphisms for non-invasive prenatal detection of aneuploidy of chromosomes 13, 18, 21, X, and Y. Prenat Diagn. 2013;33:575–9
5. Stokowski R, Wang E, White K, et al. Clinical performance of non-invasive prenatal testing (NIPT) using targeted cell-free DNA analysis in maternal plasma with microarrays or next generation sequencing (NGS) is consistent across multiple controlled clinical studies. Prenat Diagn. 2015 Dec;35(12):1243-6
6. Dahl F, Ericsson O, Karlberg O, et al. Imaging single DNA molecules for high precision NIPT. Sci Rep. 2018 Mar 14;8(1):4549
7. Kinnings SL, Geis JA, Almasri E, et al. Factors affecting levels of circulating cell-free fetal DNA in maternal plasma and their implications for noninvasive prenatal testing. Prenat Diagn. 2015;35:816–22
8. Brady P, Brison N, van Den Bogaert K, et al. Clinical implementation of NIPT - technical and biological challenges. Clin Genet. 2016 May;89(5):523- 30
9. Gil MM, Accurti V, Santacruz B, Plana MN, Nicolaides KH. Analysis of cell-free DNA in maternal blood in screening for aneuploidies: updated meta-analysis. Ultrasound Obstet Gynecol. 2017;50:302–14
10. van der Meij KRM, Sistermans EA, Macville MVE, et al. Dutch NIPT Consortium. TRIDENT-2: National Implementation of Genome-wide Non-invasive Prenatal Testing as a First-Tier Screening Test in the Netherlands. Am J Hum Genet. 2019 Dec 5;105(6):1091-1101
11. Srebniak MI, Knapen MFCM, Govaerts LCP, et al. Social and medical need for whole genome high resolution NIPT. Mol Genet Genomic Med. 2020 Jan;8(1):e1062
12. Shaw J, Scotchman E, Chandler N, Chitty L. Non -invasive prenatal testing for aneuploidy, copy number variants and single gene disorders. Reproduction. 2020 Mar 1, doi: 10.1530/REP-19-0591
13. Gil MM, Revello R, Poon LC, et al. Clinical Implementation of Routine Screening for Fetal Trisomies in the UK NHS: Cell-Free DNA Test Contingent on Results From First-Trimester Combined Test. Ultrasound Obstet Gynecol. 2016 Jan;47(1):45-52
14. Wald NC, et al. Prenatal reflex DNA screening for trisomies 21, 18, and 13. Genetics in Medicine. 2018;20(8):825–830
15. https://slg.cz/doporuceni/prenatalni-diagnostika/indikace-neinvazivniho-prenatalniho-testovaninipt/
16. https://slg.cz/doporuceni/prenatalni-diagnostika/
17. Vogel I, Petersen OB. Prenatal screening for atypical chromosomal abnormalities: past or future? Ultrasound Obstet Gynecol. 2018 Apr;51(4):434- 43
18. Putzova M, Pecnova L, Dvorakova L, et al. Omni- Plex--a new QF-PCR assay for prenatal diagnosis of common aneuploidies based on evaluation of the heterozygosity of short tandem repeat loci in the Czech population. Prenat Diagn. 2008 Dec;28(13):1214-20
19. Trková M, Putzová M, Bečvářová V, et al. Implementace array vyšetření do prenatální diagnostiky v I. trimestru. Česká gynekologie. 2015;80(3):176-180
20. Springer D, Loucký J, Gregor V, et al. Využití NIPT při definovaném hraničním výsledku konvenčního screeningu dle Doporučení ČSKB a SLG a možnosti úhrady v roce 2020. Actual Gyn. 2020;12:8
21. Gadsboll K, Petersen OB, Gatinois V, et al. Current use of noninvasive prenatal testing in Europe, Australia and the USA: A graphical presentation. Acta Obstet Gynecol Scand. 2020 Jun;99(6):722- 730
22. Iwarsson E, Conner P. Detection rates and residual risk for a postnatal diagnosis of an atypical chromosome aberration following combined first-trimester screening. Prenat Diagn. 2020;40(7):852- 859, doi: 10.1002/pd.5698
23. Petersen AK, Cheung SW, Smith JL, et al. Positive predictive value estimates for cell-free noninvasive prenatal screening from data of a large referral genetic diagnostic laboratory. Am J Obstet Gynecol. 2017 Dec;217(6):691
24. Srebniak MI, Joosten M, Knapen MFCM, et al. Frequency of submicroscopic chromosomal aberrations in pregnancies without increased risk for structural chromosomal aberrations: systematic review and meta-analysis. Ultrasound Obstet Gynecol. 2018 Apr;51(4):445-452
25. Levy B, Wapner R. Prenatal diagnosis by chromosomal microarray analysis. Fertil Steril. 2018 Feb;109(2):201-212
26. Evans MI, et al. The epidemic of abnormal copy number variant cases missed because of reliance upon noninvasive prenatal screening. Prenat Diagn. 2018 Sep;38(10):730-734
27. Vogel I, Petersen OB, Christensen R, et al. Chromosomal microarray as primary diagnostic genomic tool for pregnancies at increased risk within a population-based combined first-trimester screening program. Ultrasound Obstet Gynecol. 2018 Apr;51(4):480-486
28. Lord J, et al. Prenatal Assessment of Genomes and Exomes Consortium. Prenatal exome sequencing analysis in fetal structural anomalies detected by ultrasonography (PAGE): a cohort study. Lancet. 2019 Feb 23;393(10173):747-757
29. Deden C, Neveling K, Zafeiropopoulou D. Rapid whole exome sequencing in pregnancies to identify the underlying genetic cause in fetuses with congenital anomalies detected by ultrasound imaging. Prenat Diagn. 2020;40(8):972-983, doi: 10.1002/pd.5717
30. Koumbaris G, Achilleos A, Nicolaou M, et al. Targeted Capture Enrichment Followed by NGS: Development and Validation of a Single Comprehensive NIPT for Chromosomal Aneuploidies, Microdeletion Syndromes and Monogenic Diseases. Mol Cytogenet. 2019 Nov 21;12:48