Úvod

Endometrióza je estrogen-dependentní, zánětlivé, systémové a chronické onemocnění, jehož charakteristickým znakem je přítomnost ektopicky uložených endometriálních žlázek a stromatu mimo dutinu děložní. Odhaduje se, že postihuje přibližně 5 až 10 % žen v reprodukčním věku, skutečný počet ale znám není a je pravděpodobně vyšší. I když existuje řada teorií o patogenezi tohoto onemocnění, přesný mechanizmus vzniku nebyl stále objasněn. Jednotlivé teorie shrnuje Obr. 1. Svůj podíl na vzniku endometriózy má nejspíše retrográdní menstruace, nicméně její přítomnost byla prokázána u 76 až 90 % žen s přítomnými vejcovody (1,2). U žen s endometriózou bývá ale tento retrográdní tok krve intenzivnější a může být doprovázen i abnormální myometriální kontrakcí (3). Neméně významný podíl na rozvoji onemocnění bude mít stav imunitního systému, kdy v posledních letech výrazně narůstá počet důkazů o propojenosti endometriózy s přítomnými odchylkami v místní i systémové imunitní odpovědi (4). U pacientek jsou nacházeny poruchy jak humorální, tak buněčné imunity, zahrnující peritoneální infiltraci imunitními buňkami, aktivaci makrofágů, redukovanou aktivitu cytotoxických T-lymfocytů, posun poměru TH1/TH2 směrem k TH2 a produkci protilátek plazmatickými buňkami (anti-endometriální, anti-fosfolipidové, anti-nukleární) (5).

Vznik endometriózy bývá často spojován s některými rizikovými faktory, jako například: nízká porodní hmotnost, časná menarché, krátký menstruační cyklus, dysperistaltika vejcovodů a uteru, nízká hodnota body mass indexu (BMI), snížený poměr pasu k bokům (waist-hip ratio) či např. expozice diethylstilbestrolu in utero nebo dalším chemickým látkám ovlivňující endokrinní orgány (6–8). Jako protektivní faktor se naopak jeví pozdní menarché, dlouhodobé kojení, multiparita či alkoholová abstinence (7).
I když je klinická manifestace onemocnění bohatá a zahrnuje příznaky jako dysmenorea, dyspareunie, dyschezie, dysurie, chronická pánevní bolest, či neplodnost, nebývá její diagnostika vždy dostatečně včasná. Vzhledem k tomu, že není známa kauzalita onemocnění, jsou léčebné možnosti stále značně omezené a u některých žen neefektivní.
Cílem naší práce byla základní charakteristika žen s přítomným endometriomem v porovnání s kontrolní skupinou zdravých žen. Podrobněji byly sledovány jednotlivé subpopulace lymfocytů a to konkrétně počet T-lymfocytů (CD3+), pomocných T-lymfocytů (TH-lymfocyty, CD4+), cytotoxických T-lymfocytů (TC-lymfocyty, CD8+), vzájemný poměr CD4+/CD8+, dále počet aktivovaných T-lymfocytů (CD3+/HLA DR+), dvojitě negativních T-lymfocytů (CD3+CD4-CD8-), B-lymfocytů (CD19+) a NK buněk (natural killer, přirozený zabíječ).

Metodika

Studovaný soubor

Studovaný soubor tvořilo 20 žen, jednalo se o 10 pacientek s endometriózou a 10 zdravých žen. U souboru pacientek se jednalo o ženy, které byly vyšetřeny v Endokrinologické ambulanci Gynekologicko-porodnické kliniky Fakultní nemocnice v Plzni a na základě anamnézy, klinického obrazu a sonografického vyšetření jim byla stanovena diagnóza endometriózy, a to konkrétně ve formě ovariálního endometriomu.
Jednalo se o prvozáchyt tohoto onemocnění, kdy žádná z žen nebyla v minulosti kvůli tomuto onemocnění léčena. Diagnóza byla potvrzena laparoskopickým výkonem.
Od každé ženy byly získány základní anamnestické informace – věk, váha, výška, body mass index (BMI), věk menarché, délka menstruačního cyklu a délka krvácení.
Studie byla schválena Etickou komisí Lékařské fakulty v Plzni a všechny ženy podepsaly informovaný souhlas.

Stanovení subpopulací lymfocytů

Při návštěvě Endokrinologické poradny Gynekologicko- porodnické kliniky Fakultní nemocnice v Plzni byl ženám odebrán vzorek periferní krve do K3EDTA Vacuette. Stanovení jednotlivých podtypů lymfocytů bylo provedeno na Ústavu imunologie a alergologie Fakultní nemocnice v Plzni. Sledováno bylo zastoupení T-lymfocytů (CD3+) - pomocných T-lymfocytů (TH-lymfocyty, CD3+CD4+), cytotoxických T-lymfocytů (TC-lymfocyty, CD3+CD8+), jejich vzájemný poměr CD4+/CD8+, aktivovaných T-lymfocytů (CD3+/HLA DR+) a dvojitě negativních T-lymfocytů (CD3+CD4-CD8-), dále pak B-lymfocytů (CD19+) a NK buněk (natural killer, přirozený zabíječ, CD3-CD56+). Referenční hodnoty jednotlivých podtypů lymfocytů jsou uvedeny v Tab. 1.
Flow-cytometrické vyšetření bylo prováděno značením povrchových antigenů. Byly stanoveny znaky CD45, CD3, CD4, CD8, CD19, CD16, CD56 a HLA-DR. Pro stanovení byl použit kit KOMBITEST CD3 FITC/ CD4 PE-Cy7/CD8 APC-Cy7/CD16 + CD56 PE/CD19 APC/CD45 PerCP-Cy 5.5 (Exbio, Česká republika). Analýza byla provedena na průtokovém cytometru Navios (BeckmannCoulter, USA). Získané výsledky byly vyhodnoceny v programu Kaluza (Beckmann- Coulter, USA).

Statistické vyhodnocení

Statistické vyhodnocení bylo zpracováno pomocí metody dvouvýběrového t-testu. Za statisticky významný rozdíl byla považována hladina významnosti 5 % (p ≤ 0,05).

Výsledky

Sledovaný soubor

Do studie bylo zařazeno 10 pacientek s endometriomem z Endokrinologické ambulance Gynekologickoporodnické kliniky Fakultní nemocnice v Plzni a 10 zdravých žen, které vykazovaly normální klinický a ultrazvukový nález při provedené preventivní prohlídce. Průměrný věk pacientek byl 31,00 let (SD ± 7,21), u kontrol se jednalo o 34,10 let (SD ± 7,41). Od žen byly získány základní osobní informace – věk, váha, výška, body mass index (BMI), věk menarché, délka menstruačního cyklu a délka krvácení. Tuto základní charakteristiku shrnuje Tab. 2.

Průměrná váha pacientek byla 75,90 kg (SD ± 19,15), výška 173,00 cm (SD ± 6,27) a BMI 25,25 (SD ± 5,67). Z gynekologické anamnézy bylo zjištěno, že průměrná délka menstruačního cyklu žen je 29,59 dní (nejkratší cyklus 28 dní a nejdelší 34 dní), délka krvácení je 6,55 dne (SD ± 2,04) a první menstruaci měly ženy průměrně ve 12,80 letech (SD ± 1,23).
U zdravých kontrol byla průměrná váha 69,95 kg (SD ± 19,77), výška 166,35 cm (SD ± 9,52) a BMI 25,03 (SD ± 5,82). Průměrná délka menstruačního cyklu byla 29,39 dní (nejkratší cyklus 26 dní a nejdelší 35 dní), délka krvácení 4,70 dne (SD ± 0,95) a rok menarché 13,30 let (SD ± 1,34).
Mezi pacientkami a zdravými dárkyněmi byla nalezena statistická významnost v délce menstruačního krvácení, kdy u žen s endometriózou trvalo krvácení déle (6,55 ± 2,04 dne versus 4,70 ± 0,95 dne). V ostatních sledovaných parametrech nebyl nalezen statisticky významný rozdíl mezi skupinami.

Stanovení subpopulací lymfocytů

V periferní krvi bylo sledováno zastoupení jednotlivých podtypů lymfocytů. U žen s ovariálním endometriomem byl nalezen signifikantně nižší počet TH-lymfocytů (0,80 x 109/l (SD ± 0,21) vs. 1,13 x 109/l (SD ± 0,40)) a aktivovaných T-lymfocytů (0,07 x 109/l (SD ± 0,04) vs. 0,12 x 109/l (SD ± 0,02)). V ostatních sledovaných parametrech statisticky signifikantní rozdíl nalezen nebyl. Podrobněji jsou výsledky zobrazeny v Tab. 3 a v Obr. 2 (signifikantní rozdíl v 2 B a 2 E).

Diskuze

Endometrióza je jedním z nejčastějších gynekologických onemocnění žen ve fertilním věku. Jejími hlavními klinickými projevy je bolest a neplodnost, což ženu negativně ovlivňuje jak po stránce psychické, tak i fyzické a vede ke snížení kvality jejího života. Komplikaci přináší i dodnes neobjasněná přesná příčina vzniku tohoto onemocnění. Nejčastěji přijímanou hypotézou je, že původ onemocnění souvisí s refluxem endometria během menstruace (1). Retrográdní menstruace je ale přítomna u většiny žen, což vede k otázce, proč se u některých žen onemocnění rozvine a u jiných nikoliv. Zde hrají nejspíše zásadní roli imunitní buňky, které by měly ektopické endometriální buňky eliminovat, k čemuž u některých žen ze zatím neznámého důvodu nedochází (5). Situaci neulehčuje ani samotná stavba lézí, která je heterogenní se složkou epiteliální, endoteliální, stromální, žlázovou i imunitní, čímž vzniká vysoce komplexní a dynamické prostředí, které je ovlivňováno jak zánětlivými, tak angiogenními a endokrinními signály (9).
U žen s ovariálním endometriomem a zdravých kontrol byla provedena základní anamnestická charakteristika a stanoveny základní podtypy lymfocytů.
Z anamnestických informací byl nalezen signifikantní rozdíl v délce menstruačního krvácení, kdy pacientky udávaly průměrnou délku 6,55 dní (SD ± 2,04) oproti kontrolám, kde krvácení trvalo průměrně 4,70 dní (SD ± 0,95). Tato skutečnost podporuje hypotézu vzniku endometriózy v souvislosti s retrográdním krvácením, kdy delší doba menstruačního krvácení zvyšuje riziko jeho přítomnosti a možnosti implantace endometriální sliznice mimo dutinu děložní. Ze stejného důvodu je za rizikový faktor považován i krátký menstruační cyklus, jelikož tato skutečnost často znamená zvýšení frekvence menstruace, a tedy i zvýšené riziko retrográdního krvácení (10).
Vztah mezi BMI a endometriózou je stále diskutován a názor na něj není zcela jednoznačný. Některé epidemiologické studie ukazují na asociaci nízkého BMI s výskytem endometriózy (11), nicméně celá řada prací toto vyvrací a ukazuje pravý opak, tedy asociaci vysokého BMI s endometriózou (12). V námi sledovaném souboru jsme statistickou významnost mezi skupinami neprokázali a rozdíl mezi hodnotami BMI u sledovaných skupin byl nepatrný (25,25 ± 5,67 vs. 27,19 ± 5,39).
U lymfocytů bylo podrobněji sledováno zastoupení T-lymfocytů a jejich podtypů, B-lymfocytů a NK buněk. T-lymfocyty jsou na základě přítomnosti CD markerů děleny na dvě základní skupiny – cytotoxické T-lymfocyty (CD8+, TC-lymfocyty) a pomahačské T-lymfocyty (CD4+, TH-lymfocyty). Tyto dvě skupiny představují ~ 95 % z T-lymfocytů. Minoritní skupinu pak představují CD3+CD4-CD8- (dvojitě negativní) T-lymfocyty, jejichž počet se pohybuje od 1 do 5 % v periferní krvi. Hlavní úlohou cytotoxických lymfocytů je apoptotická likvidace nádorových, stresovaných a intracelulárními parazity infikovaných buněk. TH-lymfocyty naproti tomu fungují jako aktivátor a prostředník pro ostatní buňky imunitního systému – jsou nezbytné pro aktivaci cytotoxických T-lymfocytů, B-lymfocytů nebo makrofágů. U periferních buněk s dvojitě negativním fenotypem se ukázalo, že se podílejí zejména na imunitní regulaci a toleranci, ale mají svou úlohu i při vzniku zánětu. V námi sledovaném souboru pacientek byl nalezen signifikantně nižší počet T-lymfocytů, a to konkrétně v subpopulaci CD4+ T-lymfocytů a dále také nižší počet aktivovaných T-lymfocytů (CD3+HLA-DR+). Jelikož většina z CD3+HLA-DR+ buněk jsou cytotoxické T-lymfocyty, může být sice přítomen jejich normální počet, ale s nižším podílem aktivovaných forem. Pokles CD4+ T-lymfocytů potvrzují ve své práci i Olkowska-Truchanowicz a kol., kteří se také zaměřili na ženy s ovariálním endometriomem (13). Tato skutečnost může být např. způsobena zvýšenou expresí Fas ligandu (FasL) na endometriálních buňkách (14) nebo přítomnou hormonální nerovnováhou (15).
U B-lymfocytů není situace tak jednoznačná jako u T-lymfocytů. V námi sledovaném souboru nebyl nalezen signifikantní rozdíl mezi sledovanými skupinami žen. Stejný závěr prezentuje ve své práci i Hassa a kol. (16). Naproti tomu v jiných pracích byl prokázán jejich zvýšený i snížený počet v periferní krvi u žen s endometriózou (17).
Podobně je tomu i u NK buněk, i zde byl prokázán jejich zvýšený počet v periferní krvi u žen s endometriózou (18), jednalo se ale o pacientky s hlubokou pánevní endometriózou. Jiné studie naopak rozdíl v zastoupení NK buněk neprokázaly (19). I v našem souboru byl počet NK buněk u obou skupin srovnatelný.
Úloha dvojitě negativních T-lymfocytů v patogenezi endometriózy zatím nebyla podrobně zkoumána a v námi sledovaném souboru jsme rozdíl mezi skupinami neprokázali, ale vzhledem k jejich regulačnímu charakteru se jedná o skupinu buněk s vysokým potenciálem k následné podrobnější analýze.

Závěr

Existuje řada důkazů, že imunitní buňky hrají při vzniku endometriózy důležitou roli. Konkrétní podíl na etiopatogenezi onemocnění ale stále není znám. Obecně je nejčastěji přijímáno, že u některých žen nedochází k eliminaci ektopických endometriálních buněk imunitními buňkami, což vede k jejich proliferaci, vzniku zánětlivého procesu a rozvoji endometriózy.
V naší práci jsme odchylky v zastoupení imunitních buněk v periferní krvi u zdravých žen a žen s endometriomem nalezli, a to konkrétně u T-lymfocytů. Limitujícím faktorem naší práce je malá velikost souboru, jedná se zatím pouze o pilotní studii, kam byly vybrány pouze pacientky s ovariálním endometriomem, bez jakékoliv předchozí léčby a bez jakékoliv poruchy imunity.
Pochopení imunopatofyziologie endometriózy je stále aktuální výzvou s imunoterapeutickým potenciálem a zejména s cílem zlepšení kvality života žen s touto diagnózou.

Prohlášení o konfliktu zájmů

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie/ práce nemají žádný konflikt zájmů.

Literatura

1. Sampson JA. Heterotopic or misplaced endometrial tissue. Am J Obstet Gynecol. 1925;10:649–664
2. Halme J, Hammond MG, Hulka JF, et al. Retrograde menstruation in healthy women and in patients with endometriosis. Obstet Gynecol. 1984;64:151–154
3. Salamanca A, Beltrán E. Subendometrial contractility in menstrual phase visualized by transvaginal sonography in patients with endometriosis. Fertil Steril. 1995;64:193–195
4. Králíčková M, Vetvicka V. Immunological aspects of endometriosis: a review. Ann Transl Med. 2015;3:153
5. Abramiuk M, Grywalska E, Małkowska P, et al. The Role of the Immune System in the Development of Endometriosis. Cells. 2022;11:2028
6. Vercellini P, De Giorgi O, Aimi G, et al. Menstrual characteristics in women with and without endometriosis. Obstet Gynecol. 1997;90:264–268
7. Shafrir AL, Farland LV, Shah DK, et al. Risk for and consequences of endometriosis: A critical epidemiologic review. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 2018;51:1–15
8. Jirsová S. The effect of polychlorinated biphenyls and organochlorinated pesticides on human reproduction. Ceska Gynekol. 2018;83:380–384
9. Symons LK, Miller JE, Kay VR, et al. The Immunopathophysiology of Endometriosis. Trends Mol Med. 2018;24:748–762 
10. Wei M, Cheng Y, Bu H, et al. Length of Menstrual Cycle and Risk of Endometriosis. Medicine (Baltimore). 2016;95:e2922 
11. Shah DK, Correia KF, Vitonis AF, et al. Body size and endometriosis: results from 20 years of follow-up within the Nurses’ Health Study II prospective cohort. Hum Reprod Oxf Engl. 2013;28:1783–1792 
12. Holdsworth-Carson SJ, Dior UP, Colgrave EM, et al. The association of body mass index with endometriosis and disease severity in women with pain. J Endometr Pelvic Pain Disord. 2018;10:79– 87 
13. Olkowska-Truchanowicz J, Bocian K, Maksym RB, et al. CD4+ CD25+ FOXP3+ regulatory T cells in peripheral blood and peritoneal fluid of patients with endometriosis. Hum Reprod Oxf Engl. 2013;28:119–124 
14. Crispim PCA, Jammal MP, Murta EFC, et al. Endometriosis: What is the Influence of Immune Cells? Immunol Invest. 2021;50:372–388
15. Mjösberg J, Svensson J, Johansson E, et al. Systemic reduction of functionally suppressive CD- 4dimCD25highFoxp3+ Tregs in human second trimester pregnancy is induced by progesterone and 17beta-estradiol. J Immunol Baltim Md. 1950 2009;183:759–769
16. Hassa H, Tanir HM, Tekin B, et al. Cytokine and immune cell levels in peritoneal fluid and peripheral blood of women with early- and latestaged endometriosis. Arch Gynecol Obstet. 2009;279:891–895
17. Riccio LGC, Baracat EC, Chapron C, et al. The role of the B lymphocytes in endometriosis: A systematic review. J Reprod Immunol. 2017;123:29–34
18. Dias JA, Podgaec S, de Oliveira RM, et al. Patients with endometriosis of the rectosigmoid have a higher percentage of natural killer cells in peripheral blood. J Minim Invasive Gynecol. 2012;19:317–324
19. Thiruchelvam U, Wingfield M, O’Farrelly C. Natural Killer Cells: Key Players in Endometriosis. Am J Reprod Immunol. 2015;74:291–301 

Podpořeno projektem institucionálního výzkumu MZČR – FNPI, 00669806.